Dette første tilfælde af genetisk manipulation i et firben har skabt en modelorganisme, der kunne hjælpe med at få yderligere forståelse af krybdyrs evolution og udvikling
CRISPR-Cas9 eller simpelthen CRISPR er en unik, hurtig og billig gen redigeringsværktøj, som gør det muligt at redigere et genom ved at slette, tilføje eller ændre DNA. CRISPR akronym står for 'Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats'. Dette værktøj er enkelt og mere præcist end tidligere metoder til redigering DNA.
CRISPR-Cas9-værktøjet injicerer organismer på zygote (en-celle) stadium med en DNA-konstruktion lavet af (a) Cas9-enzym, der fungerer som 'saks' og kan skære eller slette en del af DNA, (b) guide RNA - en sekvens, som matcher målgenet og guider dermed Cas9-enzymet til målplaceringen. Når en målsektion af DNA er skåret ud, vil cellens DNA-reparationsmaskineri genforenes med den resterende streng og i processen dæmpe det målrettede gen. Eller genet kunne "korrigeres" ved at bruge en ny modificeret DNA-skabelon i en proces, der kaldes homologistyret reparation. Således giver CRISPR-Cas9 værktøj mulighed for genetiske modifikationer ved injektion gen-redigering opløsninger til et encellet befrugtet æg. Denne proces forårsager en genetisk ændring (mutation) i alle efterfølgende celler, som produceres, hvilket påvirker genfunktionen.
Selvom CRISPR-Cas9 rutinemæssigt bruges i mange arter, herunder fisk, fugle og pattedyr, har den indtil videre ikke haft succes med genetisk manipulation af krybdyr. Dette skyldes primært to barrierer. For det første opbevarer kvindelige krybdyr sæd i lang tid i deres æggeleder, hvilket gør det vanskeligt at bestemme det nøjagtige tidspunkt for befrugtning. For det andet har fysiologien af æg fra krybdyr mange funktioner som bøjelige æggeskaller, skrøbelighed uden luftrum indeni, hvilket gør det udfordrende at manipulere embryoerne uden at forårsage brud eller beskadigelse.
I en artikel uploadet på bioRxiv den 31. marts 2019 har forskere rapporteret udvikling og test af en måde at bruge CRISPR-Cas9 på genredigering hos krybdyr for første gang. Den krybdyrart, der blev valgt i undersøgelsen, var en tropisk firben kaldet Anolis sagrei eller mere almindeligt brun anole, som er udbredt i Caribien. Firbenene i undersøgelsen blev indsamlet fra en vild region i Florida, USA. Denne art er ideel til undersøgelsen på grund af dens miniaturestørrelse, lange ynglesæson og relativt korte gennemsnitlige tid mellem to generationer.
For at overvinde de begrænsninger, som krybdyr i øjeblikket står over for, mikroinjicerede forskere CRISPR-komponenter i umodne ubefrugtede æg, mens æggene stadig var i hunfirbens æggestokke før befrugtningen. De målrettede tyrosinase-genet, som producerer et enzym, der kontrollerer hudpigmentering hos firben, og hvis dette gen fjernes, ville firbenet blive født som albino. Denne klare pigmenteringsfænotype var grunden til at vælge tyrosinase-genet. De mikroinjicerede æg modnes derefter inde i hunnen og bliver efterfølgende naturligt befrugtet med en indført han eller opbevaret sæd.
Som et resultat blev fire albino-øgler født få uger senere, hvilket bekræftede, at gen-tyrosinase var deaktiveret, og genredigering processen var vellykket. Da afkommet indeholdt redigerede gen fra begge forældre, var det klart, at CRISPR-komponenter forblev aktive meget længere i moderens umodne oocyt, og efter befrugtning muterede det faderlige gener. Således udviste mutante albino-øgler manipuleret tyrosinase i gener arvet fra både mor og far, da albinisme er en egenskab, der er arvet fra begge forældre.
Dette er den første undersøgelse nogensinde, der effektivt producerer genetisk modificerede krybdyr. Forskningen kunne fungere på lignende måde i andre firbenarter som slanger, for hvilke de nuværende tilgange hidtil har været mislykkede. Dette arbejde kunne hjælpe med at få yderligere forståelse af krybdyrs evolution og udvikling.
***
Kilde (r)
Rasys AM et al. 2019. Fortryk. CRISPR-Cas9 Gen redigering i firben gennem mikroinjektion af ubefrugtede oocytter. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
***
